• Leonardo Ribeiro

Sleeping Beauty: O despertar de um poderoso sistema transposon para transgênese

Atualizado: Ago 14

- Por Leonardo Ribeiro -


The Walt Disney Company


Thomas Morgan foi até Estocolmo receber o prêmio Nobel em 1934 e durante seu discurso, ao receber o prêmio, disse: “A contribuição mais importante que a genética fez à medicina, em minha opinião, é intelectual.” Ele acabara de ser laureado por suas contribuições revolucionárias sobre variabilidade genética, estudando as Drosófilas (moscas da fruta). Para Morgan, era provável que a genética não teria qualquer relevância na medicina moderna, menos ainda no desenvolvimento de terapias. Fato é que ele não conheceu a história da “Bela Adormecida” ou Sleeping Beauty (SB). Contudo, apesar do nome, esta história não é sobre um conto de fadas.


Essa história teve início no final da década de 80, a partir de um plano governamental de recuperação do Lago Minesota, nos Estados Unidos. Tal plano visava permitir sua exploração para a atividade de pesca. Nessa época, o Dr. Perry Hackett coordenava o laboratório de pesquisa em câncer relacionado a infecções virais na Universidade de Minnesota. Sua equipe foi convidada para contribuir em um projeto de aprimoramento de peixes através da aplicação de engenharia genética. Após quase 10 anos estudando genética de peixes, o grupo liderado pelo Dr. Hacket identificou um gene que codificava um sistema transposase presente na subfamília de peixes salmonídeos. Utilizando os dados filogenéticos disponíveis, sua equipe reconstruiu, através de engenharia molecular reversa, a sequência inativa para o transposon TC1/mariner-type, tornando-o capaz de voltar a funcionar. A reativação desse sistema de transposon ancestral adormecido há cerca de 10 milhões de anos originou o nome Sleeping Beauty [1].


Transposons são elementos ou sequencias genéticas móveis que se movem de um local para outro promovendo um mecanismo de transposição no genoma. Em vertebrados, esses elementos existem como unidades móveis de DNA que contém um gene que codifica uma enzima (a transposase) flanqueada por sequências terminais de repetições invertidas (Inverted terminal repeats ou ITRs), que constituem sítios de ligação para essa enzima. No processo de transposição, a transposase medeia a excisão de uma determinada sequência de DNA, seguida pela reintegração do transposon em uma diferente região do genoma. Esse mecanismo de “corta e cola” no DNA possibilita o aumento da variabilidade, essencial no processo evolutivo dos seres vivos. Entretanto, o isolamento de elementos de transposição em vertebrados não é viável em função de sua alta taxa mutacional, o que promove a inativação das cópias ativas produtoras de transposases por um processo denominado “inativação vertical”[1].


Em 1997 foi publicado o trabalho primordial por Zoltan Ivics, que durante seu período de pós-doutoramento no laboratório do Dr. Hacket, desenvolveu o primeiro SB sintético construído através de engenharia genética. O transposon SB, renascido a partir de um gene fóssil de salmão, era não só capaz de catalisar a transposição de elementos em célula de peixes, como também em células de mamíferos [1]. O sistema SB é baseado em elementos de transposição autônoma, onde sequências ITRs flanqueiam o gene que codifica para a transposase. As sequências ITRs possuem uma identidade específica para o transposon, como região de reconhecimento da transposase. Na prática, o sistema SB é formado por um arranjo bicomposto, geralmente baseado em dois vetores plasmidiais que, combinados, integram um gene de interesse (GDI) ao genoma da célula alvo. Um componente é um vetor que contém o GDI flanqueado por ITRs e o outro componente é o plasmídeo de expressão da transposase sob o controle de um determinado promotor [2]. Há, ainda, a alternativa de utilizar como segundo componente um RNA mensageiro sintético que codifique a transposase ou mesmo a transposase em forma de proteína [3].


Nos últimos anos, o aperfeiçoamento da arquitetura molecular do sistema SB contribuiu para o aumento da eficiência dos vetores. O aumento da afinidade da transposase pelos sítios ITRs gerou as versões de vetores carreadores do GDI mais eficientes e frequentemente usadas, tais como: pT(versão original), pT2, pT3, e pT4 [2]. A transposase também foi otimizada, e última versão SB100x é até 100 vezes mais eficiente se comparada à transposase SB original (SB10) [4]. Nosso grupo demonstrou que este sistema se provou eficiente para a alteração genética de diversas células primárias e linhagens celulares humanas e de camundongos [5, 6 e 7].


O sistema SB se tornou uma das principais ferramentas de engenharia genética mediada por um vetor não viral, com amplo potencial de utilização e já teve suas primeiras utilizações em terapias genéticas. No momento, diversos estudos clínicos estão em andamento utilizando essa tecnologia no tratamento experimental de doenças como câncer, Alzheimer e a degeneração macular associada à idade [8]. Um exemplo de aplicação clínica bem-sucedida do sistema SB é sua utilização para entrega do transgene que codifica o Receptor Quimérico de Antígeno (CAR) em linfócitos T. [9, 10 e 11]. Nessa abordagem, células T isoladas a partir do sangue periférico de pacientes são modificadas para expressar o CAR, que é capaz de reconhecer antígenos na superfície de células tumorais. As células CAR-T geradas são expandidas in vitro, em seguida infundidas no paciente, eliminando assim as células alvo. Atualmente, a terapia celular para pacientes com leucemias e linfomas baseada na geração de células CAR tem revolucionado o campo das imunoterapias antitumorais [12]

Esquema da aplicação clínica do sistema SB na imunoterapia de cancer[8]


Referências:


[1]. Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, Izsvák Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 1997;91(4):501-510.

[2]. Kebriaei P, Izsvák Z, Narayanavari SA, Singh H, Ivics Z. Gene Therapy with the Sleeping Beauty Transposon System. Trends Genet. 2017; 33(11):852-870.

[3]. Wilber A, Frandsen JL, Geurts JL, Largaespada DA, Hackett PB, McIvor RS. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol Ther. 2006 Mar;13(3):625-30.

[4]. Mátés L, Chuah MK, Belay E, et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 2009 Jun;41(6):753-61.


[5]. Vargas, J.E., Chicaybam, L., Stein, R.T. et al. Retroviral vectors and transposons for stable gene therapy: advances, current challenges and perspectives. J Transl Med 2016. 14, 288

[6]. Chicaybam L, Sodre AL, Curzio BA, Bonamino MH. An efficient low cost method for gene transfer to T lymphocytes. PLoS One. 2013;8(3):e60298.

[7]. Chicaybam L, Barcelos C, Peixoto B, et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Front Bioeng Biotechnol. 2017 Jan 23;4:99.

[8]. Narayanavari, Suneel. Sleeping Beauty transposon vectors for therapeutic applications: advances and challenges. Cell & Gene Therapy Insights. 2017. 3. 131-158.

[9]. Kebriaei, P., Singh, H., Huls, M.H. et al. 2016. Phase I trials using Sleeping Beauty to generate CD19-specific CAR T cells. J. Clin. Invest. 126, 3363–3376.

[10]. Chicaybam L, Abdo L, Viegas M, et al. Transposon-mediated generation of CAR-T cells shows efficient anti B-cell leukemia response after ex vivo expansion. Gene Ther. 2020 Feb;27(1-2):85-95.

[11]. Magnani CF, Gaipa G, Lussana F, Belotti D, et al. Sleeping Beauty-engineered CAR T cells achieve anti-leukemic activity without severe toxicities. J Clin Invest. 2020 Aug 11:138473.

[12]. Pettitt D, Arshad Z, Smith J, Stanic T, Holländer G, Brindley D. CAR-T Cells: A Systematic Review and Mixed Methods Analysis of the Clinical Trial Landscape. Mol Ther. 2018 Feb 7;26(2):342-353.

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