- Por Emmanuel Arthur Albuquerque -
O sistema de transposição Sleeping Beauty é amplamente aplicado como uma ferramenta para terapia gênica. Inspirado em membros do sistema de transposon da superfamília Tc1/mariner, o gene de interesse é flanqueado por sequências chamadas de inverted terminal repeats (ITR) e transfectado na célula alvo juntamente com uma enzima transposase. A transposase é capaz de se ligar às regiões ITRs do gene de interesse e catalisar a sua integração no genoma da célula (Figura 1).
Figura 1: Zheng, J., Cao, J. and Yuan, Q. (2018). Sleeping Beauty Transposon-based System for Rapid Generation of HBV-replicating Stable Cell Lines. Bio-protocol 8(13): e2908.
Desde a primeira descrição da técnica, diferentes transposases foram idealizadas a fim de aumentar a eficácia de integração do gene de interesse. Neste sentido, a transposase SB100X é amplamente utilizada, com uma alta eficiência associada. Recentemente, Voigt e colaboradores determinaram a estrutura do domínio catalítico da proteína, possibilitando a construção de variantes com design mais racional e preditivo.
Em vista disso, Querques e colaboradores sintetizaram a transposase highly soluble Sleeping Beauty (hsSB), uma variante da SB100X com substituição de uma cisteína (C176) e uma isoleucina (I212) no domínio catalítico por uma serina – alterações idealizadas com a expectativa de aumentar a solubilidade da proteína.
Após validarem a estabilidade da nova proteína, os autores transfectaram as linhagens celulares CHO (ovário murino), mESC (tronco embriogênica murina), HeLa (câncer cervical humana) e HSCPC (tronco hematopoiética humana) com a hsSB e um gene repórter, demonstrando a capacidade de induzir a expressão do gene repórter em todas linhagens avaliadas, evidenciando boa eficiência do sistema na transferência gênica. Igualmente, após transfectarem células T CD8+ com o gene para CAR anti CD19 e a hsSB, obtiveram alta eficiência de transposição, de maneira equivalente ao controle positivo utilizado (transfecção com a SB100X parental).
Devido à maior solubilidade desta nova transposase, os autores também testaram sua atividade independente de metodologia de transfecção, somente adicionando a proteína no meio de cultura de células HeLa previamente transfectadas com o cassete do transposon contendo o gene repórter. A hsSB demonstrou ter uma capacidade intrínseca de penetração na célula, sendo detectada no citoplasma das células poucas horas após a adição da proteína ao meio de cultivo, e induzindo a integração genômica e posterior expressão do transgene. O mesmo ocorreu com células T CD8+ (originando células CAR-T) e ainda com uma linhagem de célula tronco pluripotente, notoriamente menos sucetíveis ao processo de transposição.
O trabalho é animador ao comprovar a funcionalidade da nova transposase, podendo ser crucial para manipulação de células menos sensíveis às metodologias de transfecção ou eletroporação e no aumento do rendimento de células viáveis. Além disso, a proteína pode ser promissora para redução dos atuais esforços e gastos para a engenharia de células se comparada às metodologias padrão em uso corrente. Por fim, ainda existem muitas possibilidades para serem exploradas dentro do seu funcionamento e mecanismo de interação, o que só a torna mais interessante como ponto de partida para futuros estudos e desenvolvimentos.
Referencias:
Querques, I., Mades, A., Zuliani, C. et al. A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion. Nat Biotechnol (2019).
Voigt, F., Wiedemann, L., Zuliani, C. et al. Sleeping Beauty transposase structure allows rational design of hyperactive variants for genetic engineering. Nat Commun (2016).
Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., & Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell (1997)