- Por Mariana Mazzi -
A imunoterapia para câncer utilizando células CAR-T, linfócitos T geneticamente modificados para expressar um receptor quimérico específico, foi uma importante mudança de paradigma no tratamento do câncer, em especial das neoplasias hematológicas CD19 positivas. Embora os resultados sejam promissores, muitos desafios se impõem, entre eles a persistência dessas células a longo prazo e manutenção da sua capacidade de resposta adequada diante de estimulações repetidas, quando há novo crescimento tumoral. Nesse sentido, as células CAR-T precisam apresentar propriedades semelhantes a células-tronco (referidas como stemness, derivado do inglês stem cell), ou seja, capacidade de auto renovação e de proliferação e diferenciação em células efetoras(1).
Um dos desafios para a persistência a longo prazo dos linfócitos CAR-T é o processo de encurtamento telomérico. Telômeros são estruturas especializadas na extremidade dos cromossomos, com a função de proteger o DNA genômico de degradação e fusão intercromossômica (2). O DNA telomérico consiste em repetições aleatórias da sequência TTAGGG, associadas a um complexo de 6 proteínas chamado shelterina ou telossomo, que mantem a estrutura telomérica e inibe a ativação de vias de reparo ao DNA (3),(4). Porém, dentro do processo normal de replicação do DNA, o telômero sofre encurtamento a cada ciclo celular, e quando o comprimento atinge um valor crítico, as células entram em apoptose ou senescência(5).
Um dos mecanismos mais importantes para manutenção dos telômeros é a ativação da telomerase, uma transcriptase reversa capaz de sintetizar as repetições teloméricas. De fato, a ativação da telomerase parece ser um mecanismo importante na manutenção do fenótipo de stemness, e as células germinativas e células-tronco apresentam alta atividade dessa enzima, assim como mais de 85% das células tumorais(6,7). Os linfócitos T ativados após formação das sinapses imunológicas com células apresentadoras de antígenos (APCs) aumentam a atividade da telomerase, importante para sustentar a extensa expansão clonal. Porém, estimulações repetidas não tem a mesma capacidade de ativação enzimática, e o processo de senescência se impõe(7,8).
A tentativa de indução de expressão constitutiva da telomerase para sustentar a capacidade replicativa das células T parece uma opção atraente. Porém existem graves preocupações quanto a segurança, relacionadas a instabilidade cromossômica e potencial oncogênico. Nesse sentido, um artigo publicado ainda no formato de preprint por Vaz et al traz uma descrição inédita e bastante promissora, da transferência de DNA telomérico pelas células apresentadoras de antígenos (APCs) aos linfócitos T através de vesículas extracelulares, propondo uma nova estratégia de manutenção da integridade telomérica (5).
As APCs são determinantes para início da resposta imune adaptativa, uma vez que fagocitam, processam e apresentam os antígenos aos linfócitos T através do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Após a reconhecimento antigênico, os linfócitos são ativados, proliferam e sofrem diferenciação terminal. O primeiro passo descrito no artigo foi a formação de sinapses antígeno-específicas, com cultura de linfócitos T CD4 e APCs autólogas pulsadas com antígenos virais. Após 24h, as sinapses foram desfeitas e uma análise de fragmentos de restrição telomérica mostrou o aumento de 3Kb dos telômeros das células T, concomitante a encurtamento semelhante dos telômeros das APCs. A inibição da subunidade catalítica da telomerase (TERT) e da DNA polimerase não afetaram o alongamento dos telômeros, confirmando ser um processo independente da telomerase e da síntese de DNA.
Foi então questionado se as APCs estariam doando telômeros para células T através das sinapses imunológicas. De fato, através de IF-FISH foi demonstrado que as APCs polarizam seus telômeros em agregados quando há formação de sinapses antígeno-específicas com linfócitos T. Foi observado que o DNA telomérico também é liberado no meio de cultura, encapsulado em vesículas lipídicas., uma vez que só poderia ser digerido pela DNAase I na presença de um detergente não-iônico. Análise do sobrenadante por imunofluorescência mostrou que DNA telomérico foi encontrado em cerca de 10% das vesículas, e microscopia eletrônica de varredura mostrou que maioria dessas vesículas tinha tamanho de 56nm±21nm, compatível com exossomos.
O estudo da composição proteica das vesículas por immunoblotting evidenciou a presença de uma proteína específica do telômero, TZAP, que faz a clivagem do DNA. O silenciamento de TZAP por RNAs pequenos de interferência (siRNAs) inibiu a liberação de vesículas com telômeros pelas APCS.
Foi investigado então se as células T incorporariam os telômeros doados pelas APCs. O DNA das APCs foi marcado com bromodeoxiuridina (BrU) e as vesículas secretadas BrU+ foram incubadas com linfócitos T. Análise das metáfases por IF-FISH demostrou que 10% dos cromossomos dos linfócitos apresentavam DNA telomérico doado pelas APCs. Essas vesículas também apresentam Rad51, o fator de recombinação homóloga envolvido no alongamento do telômero. Silenciamento de Rad51 através de siRNAs não afeta a estrutura ou liberação dessas vesículas, porém impede a fusão do DNA telomérico doado pelas APCs ao DNA linfocitário.
A seguir, foi estudado qual componente da sinapse desencadearia a liberação de telômeros. Foi descrito previamente que os linfócitos T liberam vesículas extracelulares ricas em TCR (TCRV) nas sinapses. Usando um modelo de sinapse substituta em bicamada plana, construído com anti-CD3 e anti-ICAM1, foi observado que as TCRVs eram suficientes para induzir a liberação de vesículas com telômeros pelas APCs, num mecanismo dependente da expressão de MHC classe II e da sinalização intracelular de cálcio nas APCs.
Por outro lado, num modelo de estimulação das APCs com ionomicina, que prescinde das células T ou TCRVs, foi observado aumento da expressão e da atividade de TZAP, concomitante à redução na expressão de shelterina em torno de 50-80%, levando a liberação dos telômeros sem o telossoma. O tratamento das APCs com o inibidor de proteassoma MG-132 impede a degradação da shelterina e liberação das vesículas, sugerindo uma via de degradação proteassômica cálcio-dependente, desencadeada após formação da sinapse imunológica.
Embora as células T possam ativar telomerase, sua atividade é insuficiente para prevenir encurtamento telomérico, especialmente em telômeros ultracurtos (abaixo de 3Kb). Utilizando análise de comprimento de telômero pelo método U-STELA, foi demonstrado que a carga de telômeros ultracurtos nos linfócitos T foi reduzida de aproximadamente 4 para 1, após incubação com vesículas contendo telômeros. Num modelo in vitro de cultura prolongada, o tratamento com vesículas com telômeros aumentou a expansão linfocitária em 3x comparado ao controle. Análise por citometria mostrou redução dos marcadores associados a exaustão, com PD-1 e CTLA-4, e inibição da expressão de beta-galactosidade, um marcador de senescência.
Finalmente, foi investigada a possibilidade de transferência telomérica in vivo. Num modelo antígeno específico (OTII-OVA), foi demonstrada a transferência de telômeros entre linfócitos T e APCs em camundongos. Os autores mostraram também que a infusão de linfócitos T OVA-específicos pré-tratados com as vesículas com telômeros, seguida de vacinação dos animais com OVA, aumentou a expansão linfocitária em 10 vezes comparado ao controle, demonstrando aumento da sobrevida celular in vivo.
Como conclusão, os autores sugerem que as APCs doariam vesículas com telômeros para aumentar a sobrevida das células T. Esse mecanismo seria particularmente importante para reduzir a carga de telômeros ultra-curtos, críticos para o processo de senescência, mas que não podem ser eliminados pela telomerase. A perda da capacidade de transferir telômeros, ao invés da redução da atividade da telomerase, poderia ser um possível mecanismo implicado no envelhecimento. Mais estudos ainda são necessários e devemos aguardar a publicação final da versão do artigo revisada por pares. No entanto, se os dados apresentados neste preprint forem confirmados por outros grupos, a transferência de telômeros através de vesículas seria uma opção atraente e possivelmente mais segura para aumentar a capacidade de expansão dos linfócitos T aplicados em imunoterapia.
REFERÊNCIAS
1. Gattinoni L, Klebanoff CA, Restifo NP. Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell. Nat Rev Cancer. Outubro de 2012;12(10):671–84.
2. Shammas MA. Telomeres, lifestyle, cancer, and aging: Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. Janeiro de 2011;14(1):28–34.
3. Blasco MA. Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond. Nat Rev Genet. Agosto de 2005;6(8):611–22.
4. de Lange T. Shelterin-Mediated Telomere Protection. Annu Rev Genet. 23 de Novembro de 2018;52(1):223–47.
5. Hodes RJ, Hathcock KS, Weng N. Telomeres in T and B cells. Nat Rev Immunol. Setembro de 2002;2(9):699–706.
6. Röth A, Baerlocher GM. Telomere Biology in T Cells: An Important Brake on the Road of Their Life Span? Clinical Leukemia. Fevereiro de 2009;3(1):41–6.
7. Barsov EV. Telomerase and primary T cells: biology and immortalization for adoptive immunotherapy. Immunotherapy. Março de 2011;3(3):407–21.
8. Röth A, Baerlocher GM. Telomere Biology in T Cells: An Important Brake on the Road of Their Life Span? Clinical Leukemia. Fevereiro de 2009;3(1):41–6.
9. Vaz B, Vuotto C, Valvo S, D’Ambra C, Esposito FM, Chiurchiù V, et al. Intercellular telomere transfer extends T cell lifespan [Internet]. Immunology; 2020 Out. Disponível em: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/2020.10.09.331918