- Por Luiza Abdo -
No último século, o avanço no entendimento da biologia da célula vem crescendo de forma exponencial. As células produzem milhares de proteínas que podem agir como enzimas, hormônios, estruturas celulares, auxiliar na defensa entre outras funções. Contudo, as células podem produzir proteínas defeituosas ou às vezes precisam simplesmente fazer uma limpeza do “excesso” de proteínas para regular as moléculas de seu interior. Para isso, é necessário que essas proteínas sejam marcadas e posteriormente levadas à degradação. Esse processo de marcação foi denominado ubiquitinação, no qual moléculas de ubiquitina se ligam às proteínas alvo. A relevância dessa descoberta para o homeostasia da célula foi reconhecida com a concessão do Prêmio Nobel de Química no ano de 2004 para os seus descobridores: Aaron Ciechanover, Avram Hershko e Irwin Rose.
A ubiquitinação desempenha uma importante função na regulação das proteínas nas células. De forma reducionista, esse processo consiste em marcar as proteínas alvo com sequencias de ubiquitinas para que estas proteínas sejam agora degradadas. Geralmente as proteínas marcadas são levadas aos proteassomas, que têm como função degradar proteínas. Porém, a maneira em que as ubiquitinas se dispõem na superfície das proteínas alvo podem encaminhá-las para os lisossomas, que são organelas com enzimas digestivas. Além disso, as ubiquitinas adicionadas a proteínas, também participam de processos de regulação do ciclo celular, reparo de DNA e transcrição gênica.
Quando ocorre uma melhor compreensão dos processos das células no geral, pode ocorrer também um melhor entendimento de certas patologias ou possíveis usos desses processos para benefícios em tratamentos e terapias. Neste texto, vamos discutir um pouco sobre o artigo publicado pelo grupo de LI, Wentao e colaboradores, que descreve a otimização de Receptores Quiméricos de Antigenos (CAR) em células T quando estes perdem a capacidade de serem ubiquitinados. Essa modificação, segundo o trabalho, pode resultar em uma melhora do efeito antitumoral, na proliferação, persistência, aumento da massa mitocondrial entre outros benefícios.
O CAR é uma quimera de um Receptor de Células T (TCR) e uma Imunoglobulina. Já está bem descrito que quando uma célula T é ativada via seus TCRs, estes receptores sofrem internalização, podendo então, sofrer ubiquitinação para posterior degradação ou serem reciclados, retornando à superfície celular. O mesmo efeito é visto com os CARs presentes nas células T, já que a sinalização através destes receptores mimetiza a ativação do TCR. Porém, o efeito da internalização do CAR é contraditório, não se sabe ao certo se isso traz vantagens ou desvantagens na promoção da sua ação antitumoral.
Com o proposito de evitar a ubiquitinação, os autores desenvolveram um CAR que possuíam todos os seus resíduos citoplasmáticos de lisina mutados para arginina (denominado 19BBz KR), já que as moléculas de ubiquitina se ligam às lisinas. Em uma série de experimentos, verificaram que, após a ativação das células T 19BBz KR, há menor degradação e menor internalização do receptor quando comparado ao 19BBz WT (versão não mutada). Ademais, análises de imunoprecipitados dos complexos proteicos pertencentes ao grupo 19BBz WT, identificaram moléculas de ubiquitinas acopladas, enquanto o mesmo não foi visto para os imunoprecipitados do grupo 19BBz KR. Para evitar o questionamento se o 19BBz KR realmente tem uma menor degradação ou se a transcrição dessa proteína é maior, foi utilizado o inibidor de síntese proteica Cicloheximida. Após o tratamento, foi averiguado o mesmo comportamento de menor internalização para 19BBz KR e maior para 19BBz WT, demonstrando que essa diferença não é relacionada à maior transcrição desses receptores mutados.
Os autores então investigaram o potencial antitumoral in vitro e in vivo contra a linhagem tumoral K562 CD19+, sendo 19BBz KR mais eficaz que a versão não mutada do CAR. A sua capacidade proliferativa também foi destacada, tanto in vitro após co-cultura com K562 CD19+, quanto in vivo, nos baços de camundongos enxertados com o mesmo tumor. Também houve mudança na fosforilação oxidativa mitocondrial e sua biogênese das células T 19BBz KR. As mitocôndrias apresentaram um maior consumo de oxigênio, tanto no nível basal quanto em seu máximo potencial, além de apresentarem maior potencial de membrana e massa mitocondrial. Isso pode contribuir para diferenciação das células em linfócitos de memória e maior persistência.
Quanto ao perfil de memória das células T 19BBz KR, o grupo constatou uma tendência para a geração de células com perfil de memória central. Já é bem descrito na literatura que quando utilizado o coestímulo 4-1BB, as células CAR-T tendem ao fenótipo de memória central e, quando utilizado CD28, se tornam células de memória efetora em sua maioria. Dito isso, a sinalização de TRAF2 e THEMIS já são reportadas após a ativação do CAR, que contém 4-1BB. Assim, como demonstrado nesse artigo, os imunoprecipitados dos complexos de proteínas derivados do grupo 19BBz KR mostraram que há maior quantidade de TRAF2 e THEMIS quando comparado ao grupo 19BBz. Esse aumento de sinalização nas vias que interagem com 4-1BB pode influenciar ainda mais na indução do fenótipo de memória central.
Deste modo, podemos concluir que, sob essas condições, as células T 19BBz KR foram otimizadas quando comparadas à sua versão com o CAR não mutado. Demonstrou-se então uma melhor atividade antitumoral, maior proliferação, melhor persistência, tendência ao fenótipo de memória central e melhor biogênese mitocondrial. Isso pode auxiliar no combate de tumores sólidos, que ainda hoje representam é uma barreira para as terapias com células CAR T.
Figura representativa adaptada do texto.
Quando há o reconhecimento do antígeno pelas células 19BBz WT, uma porção dos receptores é degradada através da via lisossomal e outra porção retorna à membrana plasmática em um processo de reciclagem (figura superior). O desenvolvimento de um receptor que não sofre ubiquitinação, 19BBz KR, tem a sua degradação inibida, induzindo apenas o processo de reciclagem (figura inferior). Essa constância de expressão dos CAR na membrana pode estar relacionada a uma otimização dessas células para a terapia com células CAR-T. Fonte.
Texto base:
LI, Wentao; QIU, Shizhen; CHEN, Jian; et al. Chimeric Antigen Receptor Designed to Prevent Ubiquitination and Downregulation Showed Durable Antitumor Efficacy. Immunity, v. 53, n. 2, p. 456-470.e6, 2020.
Referências:
The Nobel Prize in Chemistry 2004. NobelPrize.org. Disponível em: <https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2004/popular-information/>. Acesso em: 21 ago. 2020.
LI, Wentao; QIU, Shizhen; CHEN, Jian; et al. Chimeric Antigen Receptor Designed to Prevent Ubiquitination and Downregulation Showed Durable Antitumor Efficacy. Immunity, v. 53, n. 2, p. 456-470.e6, 2020.
NARAMURA, Mayumi; JANG, Ihn-Kyung; KOLE, Hemanta; et al. c-Cbl and Cbl-b regulate T cell responsiveness by promoting ligand-induced TCR down-modulation. Nature Immunology, v. 3, n. 12, p. 1192–1199, 2002.
EYQUEM, Justin; MANSILLA-SOTO, Jorge; GIAVRIDIS, Theodoros; et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature, v. 543, n. 7643, p. 113–117, 2017.
DAVENPORT, Alexander J.; JENKINS, Misty R.; CROSS, Ryan S.; et al. CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells. Cancer Immunology Research, v. 3, n. 5, p. 483–494, 2015.
LINDNER, S. E.; JOHNSON, S. M.; BROWN, C. E.; et al. Chimeric antigen receptor signaling: Functional consequences and design implications. Science Advances, v. 6, n. 21, p. eaaz3223, 2020.