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Velhos problemas e Novas soluções: Prime editing

- Por Eduardo Mannarino

A década atual é marcada por diversos avanços científicos, dentre eles a utilização de ferramentas de edição gênica na pesquisa, de forma mais específica, o uso de repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e proteínas associadas ao CRISPR (Cas), formando o sistema CRISPR/Cas, tanto para eucariotos quanto procariotos. Essa tecnologia basicamente funciona através de um RNA guia (gRNA), o qual se associa a uma proteína Cas, sendo a mais famosa a Cas9. Junto, esse complexo chamado de ribonucleoproteína (RNP), vai se parear a uma região homóloga do gRNA na sequência do DNA alvo, havendo o corte promovido pela Cas9 numa porção específica dessa sequência, gerando a “edição” (JINEK et al., 2012).

Apesar de ser uma técnica muito promissora, sua implementação para doenças de base genética com mutações pontuais, como anemia falciforme, se torna um pouco complicada, uma vez que esse sistema realiza um corte em ambas as fitas do DNA, o que pode trazer resultados indesejados, como translocações e ativação de vias apoptóticas. Além disso, o tratamento por edição genética dessas doenças depende que haja o reparo por homologia direta, através de um DNA doador, para que ocorra a correção adequada do genoma. Entretanto, essa estratégia possui uma baixa eficiência, havendo uma maior porcentagem de inserções e deleções (conhecidas como indels) (HAAPANIEMI et al., 2018; IHRY et al., 2018; KOSICKI; TOMBERG; BRADLEY, 2018).

Com isso, novas estratégias são necessárias nesse contexto de reparo do genoma, como o base editor (BE) e o prime editing (PE). A diferença entre esses sistema é o fato do primeiro ser uma Cas9 fusionada a uma deaminase, a qual permite apenas algumas trocas de base, enquanto o PE é capaz de fazer o que o BE faz e muito mais (Figura 1, Tabela 1). Essa inusitada abordagem da metodologia CRISPR é um pouco diferente do que foi originalmente descrito para edições. Começando pela estrutura, a proteína utilizada é uma Cas9 nicase, tendo apenas um dos domínios de corte funcional, fusionada por um conector flexível a uma transcriptase reversa. Isso porque a configuração do gRNA, aqui chamado de pegRNA (primer editing guide RNA), possui uma porção que se pareia com a região “alvo” do genoma e uma segunda porção que é constituída pelo domínio de ligação do pegRNA na parte cortada do DNA e o molde para transcrição reversa da sequência a ser inserida.


Figura 1. Estrutura dos Prime e Base editors. Tabela 1. Capacidade de edição do genoma.


Em relação ao funcionamento, pode ser dividido em algumas etapas. A primeira seria o reconhecimento do sítio-alvo pela porção homóloga ao DNA do pegRNA. A segunda seria o corte realizado pela Cas9, com apenas um domínio de corte ativo, na fita complementar do alvo. A terceira seria o pareamento da porção de ligação do pegRNA na parte nicada. A quarta seria a transcrição reversa do molde do pegRNA pela transcriptase reversa.

Já as etapas seguintes são comuns às edições pelas diferentes versões do PE, sendo a melhor utilizado o PE3, diferenciando-se essas versões apenas no final do processo. Finalizada a quarta etapa, a terminação não pareada gerada no sentido 3’ e o criada pelo corte da Cas9 no sentido 5’ da mesma fita, precisa ser resolvida. Neste caso há 50% de chance de nucleases clivarem tanto a ponta 3’ quanto a 5’. Caso clivem a 3’, o reparo não leva à edição desejada, entretanto se clivar a 5’, a sequência passa a ser inserida no genoma, gerando um hetero-duplex, uma vez que aquela região com a sequência nova não teria complementaridade na outra fita. Assim, o mecanismo de reparo endógeno da célula pode colocar de vez a sequência nova, corrigindo a fita complementar por se utilizar a outra (alvo) como molde, ou retornar a sequência anterior utilizando a fita complementar como molde.

O PE3 se diferencia dos outros na etapa final de resolução do hetero-duplex. Isso é feito utilizando um gRNA convencional, após a utilização do PE, que tem como alvo a fita complementar não editada, com a porção que não se pareia com a sequência desejada inserida. Dessa forma, é gerado um corte por uma Cas9, também com apenas um domínio de clivagem ativo, em um ponto distante do corte na fita alvo “original” (a onde se inseriu a sequência desejada), a fim de se evitar uma quebra de ambas as fitas do DNA, aspecto importante na utilização do PE. Assim, há um estimulo maior para que o mecanismo endógeno de reparo da célula utilize a fita editada (com a sequência inserida) como molde e assim resolva a questão do hetero-duplex, colocando uma porção complementar a sequência inserida (Figura 2).


Figura 2. Esquema adaptado de Anzalone et al, 2019 demonstrando o mecanismo de ação do PE3


Esse conjunto foi testado para editar diferentes alvos que são importantes para as doenças de base genética de mutação pontual, como a anemia falciforme, sendo capaz de mudanças de 1 nucleotídeo (nt) até 34 pares de base (pb) a jusante do sítio de corte e deleções de até 80pb. Além disso, a edição foi testada em diferentes tipos celulares, havendo uma variação de eficiência, entretanto ainda presente o efeito de correção. Isso, no contexto de patologias com mutações pontuais, é favorável, uma vez que nestas doenças as alterações genéticas envolvem inserções, deleções ou trocas, podendo ser facilmente corrigida por esse sistema, sem haver a necessidade da quebra de ambas as fitas do DNA ou de um DNA doador.

Em comparação com abordagem tradicional de reparo, como DNA doador, esse sistema apresentou um maior êxito, tendo um menor número de indels. Entretanto, em termos de nocaute, ainda seria melhor a utilização da Cas9 tradicional. Com isso, surge uma nova possibilidade de abordagem terapêutica para se tratar de doenças com base genética pontual de forma mais eficiente.


 

Artigo base:

ANZALONE, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, v. 576, n. 7785, p. 149–157, 2019.


Referências complementares:

HAAPANIEMI, E. et al. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine, v. 24, n. 7, p. 927–930, 2018.


IHRY, R. J. et al. P53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nature Medicine, v. 24, n. 7, p. 939–946, 2018.


JINEK, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, v. 337, n. 6096, p. 816–821, 2012.


KOSICKI, M.; TOMBERG, K.; BRADLEY, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology, v. 36, n. 8, p. 765–771, 2018.

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